pull down实验检测测试的简单介绍

pull down实验检测测试的详细信息

样品要求

蛋白样品-80℃保存，干冰寄送，下单前请先和工作人员沟通，确认测试细节。

常见问题

为什么会有假阳性的结果出现？

由于内源性蛋白的干扰，高纯度的GST融合蛋白能够减少实验的假阳性。由于高纯度的融合蛋白能减少实验结果的假阳性，因此获得高纯度的融合蛋白对于GST-pull down 实验结果 分析具有重要的作用。同时，为了能够程度的保证融合蛋白原有的生物学活性，一般在获取融合蛋白时倾向于可溶性融合蛋白，因此获得高纯度的可溶性蛋白很关键。 对于可溶性蛋白的获得条件主要有载体的选择。可溶性蛋白表达条件的选择，诱导温度，诱导时间，诱导物的浓度，能够不被细胞代谢而且具有稳定的浓度。

DNA pull down 常见问题

1：适配子DNA单链，可以用带有互补链的磁珠进行pull down吗？如果可以，效率怎么样？一般需要怎么优化条件？

理论上说,若DNA单链能够与磁珠上的互补链杂交成功,是可以进行pull down实验的; 效率如何不好确定,这个取决于两条DNA单链是否能杂交成功、蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。

2：DNA pull down的 原理？

针对目标区域设计特异性DNA探针并进行生物素标记，生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞蛋白提取物与磁珠-DNA探针孵育，从而钓取与DNA探针有特异性结合的互作蛋白质。

3：你们对外服务的检测项目有哪些？

细胞、动物/植物组织、菌体都可以做DNA pull down, 我们还可以做的检测实验具体如下:

(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;

(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、双荧光素酶、酵母单杂等;

(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母双杂等;

(4) 细胞学检测：细胞增殖-MTT/CCK-8, 细胞凋亡, 细胞周期,细胞迁移、侵袭：划痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;

(5) 外泌体服务：提取、鉴定(Nanosight粒径检测/电镜/WB)、

测序(miRNA/lncRNA)、蛋白质组学;

(6) 转录组及蛋白质组：真核有参转录组、无参转录组、真核lncRNA、small RNA等。

4：效率有多高？

效率主要取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。

5：老师，对照组的DNA序列是怎么选择的？

一般对照组是没有探针的,对照组是磁珠beads+蛋白。

6：DNA pull down有什么缺陷吗？

DNA pull down-MS是体外研究蛋白-DNA是否有直接互作的经典技术，是将探针结合在凝胶/磁珠上，钓取与DNA探针有互作的蛋白；就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。

7：做DNA pulldown 用DNA单链好还是双链好？

常规的是用DNA双链作为探针。

8：可以简单讲一下生物素标记引物的原理吗？

主要利用生物素（biotin）和亲和素（avidin）这两种分子的独特性质; 亲和素的每个亚基都能结合一个生物素分子,两者的结合是通过生物素的脲基环部分完成的;因此可将其戊suan侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针

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